Ученые раскрыли механизмы действия химических коктейлей, обращающих старение вспять

[admin_]

Исследователи из Гарвардской медицинской школы представили новый прорывной проект, который может переосмыслить нашу концепцию процесса старения, как сообщает портал Naked Science.
С использованием шести специальных химических смесей ученые смогли обновить клетки человека всего за несколько дней, не прибегая к генетической терапии и не нарушая их естественную структуру.
Эксперимент, проведенный на лабораторных мышах, включал использование различных молекул, таких как витамины и аминокислоты. Эти химические соединения были активированы в организме мышей, что привело к ускоренному обновлению клеток и замедлению процесса старения.
Одной из ключевых особенностей этого подхода является его безопасность. Ученые подчеркивают, что эти химические смеси не вызывают никаких побочных эффектов и не нарушают структуру ДНК клеток. Это отличает данное исследование от генетической терапии, которая может иметь непредвиденные последствия.
Лидер исследовательской группы отмечает, что эта разработка обладает огромным потенциалом в области борьбы со старением и возможностями омоложения. В будущем, эти химические смеси могут быть использованы для повышения здоровья и продления жизни людей.
Оказалось, все дело в новых химических коктейлях, состав которых способен без вреда омолодить клетки человеческого организма.
При старении тормозится клеточный цикл, привычные функции сходят на нет, а потому организм становится уязвим перед различными заболеваниями. Кожа и мышцы теряют эластичность, в связи с чем восстановление после переломов происходит дольше.
«До недавнего времени лучшее, что мы могли сделать, — это замедлить старение. Новые открытия предполагают, что теперь мы можем обратить его вспять», — поделились ученые.
Метод вмешательства в гены опасен, а потому ученые обратили внимание на химический омолаживающий коктейль. Идеального по эффективности состава удалось достичь за счет скрининга молекул.
Полученные шесть вариантов помогли восстановить молодость клеток при лабораторных исследованиях.
«Наше открытие дает возможность обратить вспять старение с помощью одной таблетки, начиная от улучшения зрения и заканчивая эффективным лечением многочисленных возрастных заболеваний», —
По своей сути вся жизнь человека строится вокруг хранения и сохранности информации. В клетках человека, как и у всех живых организмов с оформленным ядром, есть два основных хранилища информации - геном и эпигеном. Эти хранилища хоть и работают взаимозависимо для координации работы всех молекулярных механизмов в клетке, они различаются фундаментально.

Генетическая информация может считаться цифровой, так как более-менее кодируется однозначно в виде последовательности нуклеотидов ДНК и в основном неизменна во всех клетках в течение всей жизни человека. Эпигенетическая информация, напротив, кодируется менее стабильной цифро-аналоговой системой, она различается между клетками и меняется во времени и в ответ на воздействия окружающей среды. Состоит она из информации о множестве молекулярных меток ДНК, регулирующих во время роста и деления клеток активность генов и последующие изменения в синтезе белков.

Потеря этой эпигенетической информации считается одним из признаков старения организма на клеточном уровне. Клеточное старение сначала приводит к остановке клеточного цикла, далее - потере клеточной идентичности и уже потом полной дисфункции клеток. В организме человека это выражается в снижении способности к заживлению ран, ремоделированию тканей, предотвращению рака из-за остановки деления старых и поврежденных клеток, а также в развитии других возрастных заболеваний.

Оказалось, что путем экспрессии специфических генов, называемых факторами Яманака, этот процесс можно обратить - это превратит взрослые и даже старые клетки обратно в стволовые. Все же на живых организмах такой прием работает не всегда - полученные стволовые клетки могут начать делиться неконтролируемо, приводя к развитию рака. Помимо этого, метод требует доставки генетического материала в стареющие клетки при помощи аденоассоциированных вирусов или липидных наночастиц - это вызывает определенные опасения по поводу безопасности процедуры, а также возможных побочных эффектов.

Группа исследователей нашла выход из этой ситуации. Ученые провели масштабный скрининг наборов молекул, которые способны добиться таких же результатов по омоложению клеток человека. В результате были определены шесть химических коктейлей молекул, которые восстанавливают молодость клеток менее чем за неделю без побочных эффектов в виде рака, не требуя вводить генетический материал.

Свой подход с применением специальных химических коктейлей авторы назвали методом EPOCH - эпигенетическое программирование здоровья старых клеток. Кроме описанных плюсов, EPOCH имеет еще одно важное преимущество - процесс не влияет на клеточную идентичность, то есть после процедуры старая клетка кожи не становится стволовой, а остается клеткой кожи, только более молодой. Исследователи рассказали о своем открытии
Чжэ Хен Янг1, * , Кристофер А. Петти1, * , Томас Диксон-Макдугалл1, * , Мария Вина Лопес4 , Александр Тишковский2,3 , Сун Мэйбери-Льюис1 , Сяо Тянь1 , Набила Ибрагим1 , Чжили Чен1 , Патрик Т. Гриффин1 , Мэтью Арнольд1 , Цзянь Ли1 , Освальдо А. Мартинес1,5 , Александр Бен1 , Райан Роджерс-Хаммонд1 , Сюзанна Анджели4 , Вадим Н. Гладышев2 , Дэвид А. Синклер1
1 Центр биологических исследований старения имени Пола Ф. Гленна, Департамент генетики, Институт Блаватник, Гарвардская медицинская школа (HMS), Бостон, Массачусетс 02115, США
2 Отделение генетики медицинского факультета Бригама и женской больницы Гарвардской медицинской школы, Бостон, Массачусетс 02115, США
3 Институт физико-химической биологии им. Белозерского Московского государственного университета, Москва 119234, Россия
4 Молекулярные и биомедицинские науки, Университет штата Мэн, Ороно, ME 04467, США
5 Факультет биологии и химии Массачусетского технологического института, Кембридж, Массачусетс 02142, США
* Равный вклад
Получено: 30 июня 2023 г.       Принято: 4 июля 2023 г.       Опубликовано: 12 июля 2023 г.
https://doi.org/10.18632/aging.204896
Как процитировать
Авторское право: © 2023 Yang et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution License (CC BY 3.0), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что указаны автор оригинала и источник.

Аннотация
Отличительной чертой эукариотического старения является потеря эпигенетической информации, процесс, который можно обратить вспять. Ранее мы показали, что эктопическая индукция факторов Яманака OCT4, SOX2 и KLF4 (OSK) у млекопитающих может восстановить паттерны метилирования ДНК молодости, профили транскриптов и функцию тканей, не стирая клеточную идентичность, процесс, который требует активного деметилирования ДНК. Для скрининга молекул, которые обращают клеточное старение вспять и омолаживают клетки человека без изменения генома, мы разработали высокопроизводительные клеточные анализы, которые отличают молодые клетки от старых и стареющих, включая основанные на транскрипции часы старения и анализ нуклеоцитоплазматической компартментализации в реальном времени (NCC). Мы определили шесть химических коктейлей, которые менее чем за неделю и без ущерба для клеточной идентичности восстанавливают молодой профиль транскриптов всего генома и обращают вспять транскриптомный возраст. Таким образом, омоложение путем обращения вспять возраста может быть достигнуто не только генетическими, но и химическими средствами.

Введение
Вся жизнь зависит от хранения и сохранности информации. У эукариот есть два основных хранилища информации: геном и эпигеном. Хотя эти хранилища информации работают взаимозависимо для координации производства и функционирования молекулярных механизмов жизни, они различаются фундаментальными способами. Генетическая информация является цифровой и в значительной степени согласована во всех клетках организма на протяжении всей жизни человека. Напротив, эпигенетическая информация кодируется менее стабильной цифроаналоговой системой, варьируясь в разных клетках и изменяясь в ответ на окружающую среду и с течением времени.

Известно, что по меньшей мере дюжина “признаков старения” способствует ухудшению состояния и дисфункции клеток по мере их старения [1, 2]. Мы и другие исследователи собрали убедительные доказательства, от дрожжей до млекопитающих, подтверждающие идею о том, что потеря эпигенетической информации, приводящая к изменениям в экспрессии генов, приводит к потере клеточной идентичности [3–7]. Эти результаты согласуются с информационной теорией старения, которая предполагает, что снижение объема информации, в частности эпигенетической информации, запускает каскад событий, включая митохондриальную дисфункцию, воспаление и клеточное старение [5, 7–9], что приводит к прогрессирующему снижению функции клеток и тканей, проявляющемуся в старении и возрастных заболеваниях. Ранее мы показали на мышах, что повреждения клеток, такие как двухцепочечные разрывы ДНК и дробление клеток, способствуют потере эпигенетической информации, что может привести к тому, что представляется ускорением старения и возрастными заболеваниями [7, 9].

Клеточное старение - это состояние постоянной остановки клеточного цикла, которое облегчает заживление ран, ремоделирование тканей и предотвращение рака путем остановки пролиферации в старых и поврежденных клетках [10, 11]. Старение связано с изменениями морфологии клеток, архитектуры хроматина и высвобождением факторов воспаления в процессе, называемом секреторным фенотипом, ассоциированным со старением (SASP). Переход к клеточному старению может быть инициирован потерей эпигенетической информации, а также укорочением теломер, непоправимым повреждением ДНК и цитоплазматической ДНК [7, 10-12]. Накопление стареющих клеток с возрастом способствует воспалению и генерирует дополнительные активные формы кислорода (АФК), как локально, так и по всему организму, способствуя широкому спектру возрастных заболеваний, от дегенерации желтого пятна до повышенного кровяного давления и нарушения регуляции обмена веществ [13].

Начиная с 1962 года Гердон и другие продемонстрировали, что ядра содержат необходимую информацию для создания новых особей с нормальной продолжительностью жизни [14–16]. В 2006 году Такахаши и Яманака продемонстрировали, что экспрессия четырех факторов транскрипции, OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC (совместно известных как “OSKM”), перепрограммирует потенциал развития взрослых клеток, позволяя им превращаться в различные типы клеток [17, 18]. Эти открытия положили начало области клеточного перепрограммирования, и в 2000–х годах появилась серия публикаций, показывающих, что идентичность многих различных типов взрослых клеток разных видов может быть стерта, чтобы превратиться в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, широко известные как “ИПСК” [17, 19-21].

Способность факторов Яманаки стирать клеточную идентичность подняла ключевой вопрос: возможно ли обратить вспять клеточное старение in vivo, не вызывая неконтролируемого роста клеток и онкогенеза? Первоначально казалось, что это не так, поскольку мыши умирали в течение двух дней после экспрессии OSKM. Но работа лаборатории Бельмонте, нашей лаборатории и других подтвердила, что можно безопасно улучшить функцию тканей in vivo путем импульсной экспрессии OSKM [22, 23] или путем непрерывной экспрессии только OSK, исключая онкоген c-MYC [7, 8]. Например, в зрительном нерве экспрессия комбинации трех факторов Яманака безопасно сбрасывает ДНК-метиломы и паттерны экспрессии генов, улучшая зрение у старых и страдающих глаукомой мышей с помощью в значительной степени неясного механизма, для которого требуются ДНК-деметилазы TET [8]. Многочисленные ткани, включая ткань мозга, почек и мышц, в настоящее время были перепрограммированы, не вызывая рака [7, 8, 22, 24, 25]. Фактически, экспрессия OSK по всему организму мышей продлевает их продолжительность жизни [26]. В совокупности эти результаты согласуются с существованием “резервной копии” эпигенома молодости, которая может быть сброшена путем частичного перепрограммирования для восстановления функции ткани, без стирания клеточной идентичности или вызывания опухолеобразования [7-9].

В настоящее время трансляционные приложения, направленные на обращение вспять старения, лечение травм и возрастных заболеваний, основаны на доставке генетического материала в ткани-мишени. Это достигается с помощью таких методов, как аденоассоциированная вирусная (AAV) доставка ДНК и липидная доставка РНК, опосредованная наночастицами [7, 8, 27]. Эти подходы сталкиваются с потенциальными препятствиями для их широкого использования, включая высокую стоимость и проблемы безопасности, связанные с введением генетического материала в организм. Разработка химической альтернативы для имитации омолаживающих эффектов OSK может снизить затраты и сократить сроки разработки регенеративной медицины [26, 28–31]. Это усовершенствование может способствовать лечению различных заболеваний и потенциально даже способствовать омоложению всего организма [32, 33].

В этом исследовании мы разработали и использовали новые методы скрининга, включая количественный анализ компартментализации нуклеоцитоплазмы (NCC), который позволяет легко различать молодые, старые и стареющие клетки [34, 35]. Мы определили множество новых химических коктейлей, способных омолаживать клетки и обращать вспять транскриптомный возраст в той же степени, что и сверхэкспрессия OSK. Таким образом, можно обратить вспять аспекты старения без стирания клеточной идентичности, используя химические, а не генетические средства.

Результаты
Компартментализация нуклеоцитоплазмы (NCC) нарушается в фибробластах старых особей и стареющих клетках
Для выявления небольших молекул, которые якобы обращают вспять эффекты старения, мы разработали эффективную систему с высокой пропускной способностью. Вместо того, чтобы полагаться на ограниченный набор генов, которые проявляют возрастные изменения, и для обеспечения надежности и применимости к различным типам клеток, мы стремились разработать возрастозависимый анализ, который действовал бы как суррогат клеточного здоровья и паттернов экспрессии генов молодости. Для повышения масштабируемости и простоты использования мы искали систему на основе флуоресценции, которую можно было бы количественно определять в миллионах клеток за эксперимент с помощью автоматической микроскопии.

Одним из наиболее хорошо сохраняемых физиологических признаков старения является ухудшение компартментализации нуклеоцитоплазмы (NCC), которое можно визуализировать как утечку ядерных белков в цитоплазму и неспособность белков импортироваться в ядро [34, 35]. В нейронах и астроцитах, непосредственно преобразованных из фибробластов пожилых людей, а также старых нематод и ткани мозга крыс, разрушается ядерно–поровый комплекс, что приводит к повышенной проницаемости ядра и агрегации цитозольного белка [34-36].

Для мониторинга возрастных изменений ядерной проницаемости мы внедрили репортерную систему NCC в фибробласты человека от 22-летнего донора (рисунок 1A). Макерри и eGFP были связаны с сигналом ядерной локализации (NLS) и сигналом ядерного экспорта (NES) соответственно. В здоровых молодых фибробластах клеточная локализация этих белков отчетливо разделена, тогда как в фибробластах либо от 94-летнего донора, либо от 14-летнего пациента с синдромом прогерии Хатчинсона-Гилфорда (HGPS) количество и интенсивность цитоплазматических точек Макхерри были выше, чем в фибробластах от нормального 22-летнего донора (дополнительная фигура 1). Несмотря на разницу, анализ Z-фактора показал, что система недостаточно надежна для крупномасштабных целей скрининга, что побудило нас искать альтернативу [37].

Репортерная система NCC для мониторинга клеточного старения. (А) Репортерная система NCC, встроенная в фибробласты человека. (Б) Сигналы NCC в фибробластах в состоянии покоя. (C) профили интенсивности флуоресценции, соответствующие траектории стрелки в (B). (D) Колокализация сигналов mCherry и eGFP в фибробластах в состоянии покоя с помощью корреляции Пирсона. (E) Сигналы NCC в стареющих фибробластах. (F) профили интенсивности флуоресценции, соответствующие траектории стрелки в (E). (G) колокализация сигналов mCherry и eGFP в стареющих фибробластах с помощью корреляции Пирсона. (H) Корреляция Пирсона для покоящихся и стареющих фибробластов. Данные представляют собой среднее значение ± SD. **** p t-тест.
Figure 1. The NCC reporter system to monitor cellular senescence. (A) The NCC reporter system integrated in human fibroblasts. (B) NCC signals in quiescent fibroblasts. (C) Fluorescence intensity profiles corresponding to the path of the arrow in (B). (D) The colocalization of mCherry and eGFP signals in quiescent fibroblasts by Pearson correlation. (E) NCC signals in senescent fibroblasts. (F) Fluorescence intensity profiles corresponding to the path of the arrow in (E). (G) The colocalization of mCherry and eGFP signals in senescent fibroblasts by Pearson correlation. (H) Pearson correlation of quiescent and senescent fibroblasts. Data are mean ± SD. ****p < 0.0001. Two-tailed Student’s t test.

Клеточное старение сопровождается существенной реорганизацией ядерной оболочки и нарушением нуклеоцитоплазматического транспорта, включая измененную экспрессию и деградацию ламина B1, а также образование фрагментов цитоплазматического хроматина (CCF) [38–45]. Таким образом, мы пришли к выводу, что стареющие фибробласты могут генерировать сильный сигнал в репортерной системе NCC, который можно использовать для скрининга молекул для обращения вспять эпигенетического старения. Старение может быть индуцировано различными способами, включая эрозию теломер, экспрессию онкогена и повреждение ДНК [13, 46]. Поскольку репликативное старение ускоряет часы метилирования ДНК, а старение, вызванное повреждением ДНК, - нет [46, 47], мы предположили, что репликативно стареющие клетки могут быть более устойчивыми и надежными в поиске эпигенетических коктейлей для изменения возраста, чем другие типы стареющих клеток.

Чтобы избежать непреднамеренных эффектов ложного омоложения, вызванных увеличением небольшого процента способных к репликации клеток в стареющей популяции, все эксперименты проводились в условиях низкого содержания сыворотки, которые полностью подавляли деление клеток [48]. В нестареющих контрольных фибробластах в состоянии покоя сигналы mCherry и eGFP были четко различимы (рисунок 1B–1D). Стареющие фибробласты получали пассированием ~40 раз, каждый раз с разведением 1:3-1:5 на свежей среде, до полного отсутствия роста в течение двух недель, изменений морфологии, характерных для стареющих клеток, резкого увеличения транскриптов регулятора клеточного цикла p21 (CDKN1A) и других изменений экспрессии генов, связанных со старением (дополнительная фигура 2B, 2C). В стареющих фибробластах mCherry агрегировался в цитоплазме и колокализовался с eGFP (рисунок 1E–1G), что согласуется с предыдущим отчетом [34, 35]. Колокализация сигналов, измеренная с помощью корреляции Пирсона, была значительно выше в репликативно стареющих клетках по сравнению с клетками в состоянии покоя (рисунок 1H). Эти эксперименты показали, что система NCC может отличать нестареющие клетки от репликативно стареющих, по существу, в режиме реального времени.

Изменение характеристик клеточного старения путем эпигенетического перепрограммирования
Чтобы оценить применимость системы NCC для выявления вмешательств, восстанавливающих функции молодости и паттерны экспрессии генов, мы сначала проверили, может ли она обнаруживать эффекты генетически опосредованного эпигенетического изменения возраста. Эктопическая экспрессия факторов Яманака OCT4, SOX2 и KLF4 (OSK) восстанавливает паттерны экспрессии генов молодости, эпигенетический возраст и функции молодости старых клеток и тканей [7, 8]. Наш ранее опубликованный модуль обратного тетрациклин-контролируемого трансактиватора (rtTA) и полицистронный OSK cistron под контролем тетрациклин-индуцируемого промотора (Tet-on OSK) трансдуцировали с использованием лентивируса для создания стабильных клеточных линий из фибробластов человека и пассировали до тех пор, пока они не достигли репликативного старения. Обработки доксициклином было достаточно для активации кассеты OSK в этих фибробластах (дополнительная фигура 2A).

Транскриптомные изменения участвуют в стимулировании связанного со старением снижения функции и обеспечивают эффективные биомаркеры для прогнозирования биологического и хронологического возраста [46, 47]. Чтобы проверить, отражают ли эти фенотипические изменения более молодую эпигенетическую сигнатуру, мы проанализировали профиль транскрипции с помощью общегеномного RNAseq. Сравнение покоящихся молодых клеток с покоящимися старыми выявило 190 генов, которые были значительно активированы, и 326 генов, которые были значительно подавлены. Индукция OSK в течение четырех дней привела к снижению экспрессии в 43,2% (82) генов с повышенной регуляцией возраста и увеличению экспрессии в 65,3% (213) генов с пониженной регуляцией возраста (рисунок 2A-2D и дополнительный рисунок 2B). В целом, почти половина генов, измененных в результате старения, была восстановлена с помощью экспрессии OSK (Рисунок 2B, 2D, дополнительный рисунок 2D, 2E). Это открытие согласуется с нашими предыдущими выводами и выводами других авторов о том, что экспрессия OSK в различных типах клеток и тканях, включая фибробласты человека и мыши, может существенно восстановить эпигенетический ландшафт и паттерны экспрессии генов старых клеток [7, 8, 26]. Мы называем этот процесс методом EPOCH для эпигенетического программирования здоровья старых клеток.

OSK-опосредованное частичное перепрограммирование улучшает признаки клеточного старения. (A) Тепловые карты для уровней мРНК генов, повышенных в результате старения (n=3, p-adj 2). (B) Процент генов, измененных OSK (n=3, p-adj C) Тепловые карты для уровней мРНК генов, пониженных в результате старения (p-adj 2). (D) Процент генов, измененных в результате OSK (p-adj E) Top 20 процессов генной онтологии (GO) генов, повышенных в результате старения. Красная и синяя полосы указывают на повышающую или понижающую регуляцию OSK соответственно. (F) В топ-20 входят процессы генов, которые снижаются при старении. Красные и синие полосы указывают на усиление или понижение регуляции OSK соответственно. (G) Схемы системы Tet-On OSK, интегрированной в фибробласты репортерной системы NCC. (H) Сигналы NCC и дорожка стрелок в фибробластах покоя, старения или старения + OSK. Шкала, 50 мкм. (I) профили интенсивности флуоресценции, соответствующие стрелке в (H). (J) интенсивности EGFP в цитоплазме. Данные представляют собой среднее значение ± SD. *p ***p
Figure 2. OSK-mediated partial reprogramming ameliorates features of cellular senescence. (A) Heatmaps for mRNA levels of genes upregulated by senescence (n=3, p-adj < 0.01, FC > 2). (B) Percentage of genes changed by OSK (n=3, p-adj < 0.05) among those upregulated by senescence. (C) Heatmaps for mRNA levels of genes downregulated by senescence (p-adj < 0.01, FC > 2). (D) The percentage of genes changed by OSK (p-adj < 0.05) among those downregulated by senescence. (E) Top 20 gene ontology (GO) processes of genes upregulated by senescence. The red and blue bars indicate upregulation or downregulation by OSK, respectively. (F) Top 20 GO processes of genes downregulated by senescence. Red and blue bars indicate upregulation or downregulation by OSK, respectively. (G) Schematics of the Tet-On OSK system integrated in NCC reporter system fibroblasts. (H) NCC signals and track of the arrows in quiescent, senescent, or senescent + OSK fibroblasts. Scale bar, 50 μm. (I) Fluorescence intensity profiles corresponding to the arrow in (H). (J) EGFP intensities in the cytoplasm. Data are mean ± SD. *p < 0.05; ***p < 0.001. One-way ANOVA-Bonferroni.

Gene ontology (GO) analysis indicated that the top 20 GO biological processes of upregulated genes encompassed key features of aging, including dysregulation of development, localization, and transport [7], eleven of which were reversed by OSK (Figure 2E). Despite the absence of cell division in all conditions, senescence caused subtle but significant changes in cell cycle gene mRNA levels, including p21 (Supplementary Figure 2C) [49]. Numerous cell cycle- related processes were enriched with downregulated genes by senescence, and 19 of the top 20 were reversed by OSK expression (Figure 2F). The net outcome of this was the demonstration that induction of OSK partially counteracts the aging related changes resulting from senescence.

Используя систему NCC, мы исследовали ухудшение целостности нуклеоцитоплазмы по мере перехода клеток от состояния покоя к старению и омолаживающий эффект лечения OSK на эти стареющие клетки (рисунок 2G, 2H). Профили интенсивности поперечного сечения клеток использовались для оценки корреляции между распределениями флуоресцентных молекул (рисунок 2I). По сравнению с покоящимися клетками, в стареющих клетках наблюдалось значительное увеличение агрегации mCherry и eGFP, что указывает на нарушение целостности нуклеоцитоплазмы (рисунок 2J). После четырех дней лечения OSK целостность NCC в стареющих клетках была значительно восстановлена, сравнимая с популяцией клеток в состоянии покоя, не подверженных старению (рисунок 2J). Взятые вместе, эти данные показывают, что OSK-опосредованное эпигенетическое перепрограммирование существенно обращает вспять патологию, связанную со старением, и транскриптомные изменения и что репортерная система NCC может обнаруживать омоложение стареющих клеток с помощью OSK.

Обращение изменений NCC, связанных со старением, путем перепрограммирования малых молекул
Чтобы идентифицировать небольшие молекулы, которые омолаживают старые и стареющие клетки, мы составили список молекул, которые успешно перепрограммировали соматические клетки человека и мыши в химически индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (CiPSCs) [30, 31] и протестировали их с помощью NCC-анализа. Опять же, мы использовали полностью стареющие клетки, чтобы избежать обнаружения изменений, связанных с клеточным циклом или переходом к старению. Известно, что эпигенетическое изменение возраста происходит в течение недели после OSK (M)-опосредованного перепрограммирования, в то время как эпигенетический возраст непрерывно уменьшается до плюрипотентности, достигая приблизительного возраста нуля [50–52]. Для обеспечения согласованности мы первоначально протестировали комбинации малых молекул на клетках в течение того же четырехдневного периода, который необходим OSK для безопасного и последовательного омоложения клеток.

Чтобы добиться снижения возраста без изменения идентичности клеток, мы сосредоточились на небольших молекулах, которые, вероятно, будут работать на ранних стадиях формирования CiPSC, включая вальпроевую кислоту (V), CHIR-99021 (C), E-616452 (6), транилципромин (T) и форсколин (F). Предыдущие исследования эффективности перепрограммирования с использованием малых молекул продемонстрировали, что либо один OCT4, либо SKM в сочетании с VC6T или F, соответственно, могут генерировать ИПСК, а VC6TF облегчает переход от мезенхимы к эпителию, раннюю стадию перепрограммирования в клетках мыши [31, 53]. Из-за известных различий в дифференцировке между мышами и людьми мы также исследовали молекулы, о которых сообщалось для начальных состояний генерации CIPSC человека, включая CHIR-99021 (C), E-616452 (6), TTNPB (N), Y-27632 (Y), сглаженный агонист (Ы) и ABT-869 (A) [30]. Молекулы VC6TF (коктейль 1:C1) и C6NYSA (коктейль 4:C4) использовали в качестве базового коктейля для перепрограммирования и дополняли другими бустерами, которые, как известно, повышают эффективность iPSC, включая бутират натрия, основной фактор роста фибробластов (bFGF) и альфа-кетоглутарат (α-KG) (Рисунок 3A, 3B, дополнительные таблицы 1 и 2) [54].

Перепрограммирующие низкомолекулярные коктейли восстанавливают изменения NCC в стареющих клетках. (А) Химические структуры малых молекул базальных коктейлей, используемых для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток мыши (слева) или человека (справа). (B) Корреляционные тепловые карты, показывающие колокализацию eGFP и mCherry в стареющих фибробластах человека, демонстрируют эффекты 80 различных комбинаций малых молекул (n=2). (C, D) Проверка шести выбранных коктейлей с помощью независимых экспериментов, показывающих колокализацию (C) и репрезентативные изображения (D) сигналов eGFP и mCherry. Масштабная шкала, 50 мкм. Данные представляют собой среднее значение ± SD. *p **p ****p
Figure 3. Reprogramming small molecule cocktails restore NCC alterations in senescent cells. (A) Chemical structures of small molecules of basal cocktails used to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from mouse (left) or human (right) somatic cells. (B) Correlation heatmaps showing eGFP and mCherry colocalization in human senescent fibroblasts demonstrate the effects of 80 different combinations of small molecules (n=2). (C, D) Validation of six selected cocktails through independent experiments, showing colocalization (C) and representative images (D) of eGFP and mCherry signals. Scale bar, 50 μm. Data are mean ± SD. *p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.0001. One-way ANOVA-Bonferroni.

Основываясь на том факте, что ИПСК также могут быть получены с использованием только SKM или O [55, 56], мы оценили влияние ускорителей на VC6T (альтернатива SKM) и F (альтернатива O). Мы также оценили эффект комбинаций, включающих C6N, поскольку сообщалось, что удаление Y, S или A из коктейля 4 (C6NYSA) не снижало эффективность CiPSC [30]. Среди 80 коктейлей, протестированных в анализе NCC, базальный коктейль VC6TF был наиболее эффективным при восстановлении целостности нуклеоцитоплазматической компартментализации, ключевого признака изменения возраста (рисунок 3B). В недавнем неопубликованном исследовании сообщалось, что предварительная обработка 6T предотвращает старение фибробластов человека, а 6, T или 6T продлевает продолжительность жизни Caenorhabditis elegans до 42,1% [57]. Мы, однако, не увидели никакой пользы от одного F или коктейля VC6T в отношении изменения фенотипов старения в нашей системе (рисунок 3B). Затем мы выбрали шесть коктейлей из малых молекул для дальнейшего исследования, три из которых были основаны на коктейле 1, а также двух добавках (называемых коктейлями 2 и 3), а остальные три - на коктейле 4 плюс дополнительные добавки (называемые коктейлями 5 и 6) (Дополнительная таблица 2). Бутират натрия, ингибитор гистондеацетилазы, был одной из наиболее эффективных добавок как в коктейли для людей, так и для мышей (C2 и C5). Базовый фактор роста фибробластов (bFGF) использовали для коктейля 3, в то время как α-KG включали в коктейль 6. Чтобы лучше оценить влияние этих соединений на целостность NCC, мы использовали корреляцию Пирсона для оценки распределения флуоресцентных белков (рисунок 3C, 3D). Шесть коктейлей статистически улучшили компартментализацию в стареющих клетках, как с точки зрения корреляционного анализа (рисунок 3C), так и визуализации передачи сигналов NCC (рисунок 3D).

В течение почти двух десятилетий было известно, что запись и поддержание меток хроматина имеют решающее значение для перепрограммирования [58]. По этой причине мы включили ингибиторы установленных факторов ремоделирования хроматина в наш скрининг, чтобы исследовать, являются ли эти факторы барьерами или существенными факторами омоложения. Пути омоложения, инициированные C1 и C4, были заблокированы ингибированием метилтрансферазы H3K9 G9a (BIX01294, 0,5 мкм) и TGF-β (SB431542, 10 мкм), однако они не были нарушены при ингибировании компонента метилтрансферазы H3K27 PRC2, EZH2 (DZNep, 20 нМ) (рисунок 3B).

Небольшие молекулы могут изменить возраст транскриптома без потери клеточной идентичности
Основываясь на улучшении целостности NCC, мы провели RNA-seq, чтобы проверить влияние этих шести коктейлей на транскриптомный возраст. После обработки химическими веществами мы наблюдали сильное перекрытие между генами, затронутыми химической обработкой, и переход от состояния покоя к старению (дополнительный рисунок 3A). Мы также наблюдали, что две группы коктейлей, как правило, нарушали одни и те же популяции генов (дополнительная фигура 3A). Обработка химическими коктейлями не привела к тому, что фибробласты приобрели неспецифические маркеры клеточной идентичности (дополнительная фигура 3B). Наконец, мы не наблюдали экспрессии специфичных для iPSC генов или генных модулей в наборах данных RNA-seq (Дополнительный рисунок 3C, 3D). Кроме того, мы выполнили иммунофлуоресценцию в поисках признаков экспрессии генов, связанных с плюрипотентностью, таких как NANOG и EPCAM, после всех обработок коктейлем, но не смогли увидеть никакой экспрессии (дополнительная фигура 4). В совокупности эти данные указывают на то, что химически опосредованные методы лечения лишь частично перепрограммируются и не полностью восстанавливают плюрипотентность.

Затем мы протестировали влияние этих шести коктейлей на транскриптомный возраст (tAge) клеток, используя часы, обученные на мыши, человеке, и комбинированный набор обучающих данных 52. Относительный возраст транскрипции оценивали с использованием транскриптомных часов грызунов, а также комбинированных транскриптомных часов человека и грызунов (рисунок 4A, 4B). Изменение возраста определяли с использованием хронологических часов, специфичных для человека (рисунок 4C). По сравнению с покоящимися клетками, у стареющих клеток наблюдалось значительное увеличение транскриптомного возраста, основанное на транскриптомных часах, что согласуется с предыдущими результатами оценки возраста метилирования ДНК [46, 47, 59]. Обработка клеток NCC каждым из шести химических коктейлей (C1-6) приводила к статистически значимому снижению транскриптомного возраста стареющих клеток, причем полученные в исследованиях на мышах (C1-3), как правило, приводили к большему снижению транскрипционного возраста по сравнению с коктейлями, полученными от человека (рисунок 4A, 4B). Сообщаемая величина эффекта всех шести коктейлей различалась между гибридными и транскрипционными часами грызунов, причем гибридные часы указывали на большее снижение возраста при использовании всех шести коктейлей, при этом часы грызунов демонстрировали меньшую вариабельность между обработками.

Транскриптомное омоложение путем перепрограммирования коктейлей из малых молекул. (A, B) Дельта-транскриптомный возраст (tAgeΔ), измеряемый биологическими транскриптомными часами, построенными на транскриптомных данных грызунов и человека (A) или только на данных грызунов (B). (C) Дельта-возраст, измеренный с помощью хронологических транскриптомных часов, построенных с использованием человеческих данных. примечание: p > 0,05; *p **p ***p D) Корреляционная матрица транскриптомных различий в результате обработки коктейлем, перепрограммирования iPSC или старения. *p-adj **p-adj ***p-adj E) Обогащение путей путем коктейльной обработки, перепрограммирования iPSC или старения. Нормализованный показатель обогащения (NES) 0,05 p-adj *p-adj **p-adj ***p-adj F) Пиктограмма результатов исследования, показывающая, что как индукция OSK, так и лечение C1-6 восстанавливают целостность NCC, профили транскриптов и изменяют биомаркеры здоровья. Создано с использованием https://www.biorender.com.

Immunofluorescence
Клетки фиксировали в 3,7% параформальдегиде (PFA) в течение 15 минут и трижды промывали 1X PBS. Затем клетки проницали 0,1% Тритоном Х-100 в PBS с последующим 30-минутным блокированием 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS + 0,1% Твин-20 (PBST) + 22,52 мг/мл глицина. Первичные антитела использовали в следующих концентрациях в 1% BSA в PBST: NANOG (Invitrogen, PA5-85110) 1:200 и EPCAM (Abcam, ab71916) 1:100. Первичные антитела инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей трехкратной промывкой PBS. Затем использовали вторичные антитела в соотношении 1:1000 с 1% BSA в PBST (козий анти-кроличий Alexa Fluor™647, Invitrogen A-21244 или козий анти-кроличий Alexa Fluor™488, Invitrogen A-11008), инкубировали в течение одного часа, а затем трижды промывали PBS. Ядерное контркрашивание проводили в течение 15 минут с использованием Hoechst 33342 (1:2000 в PBS) с последующей заключительной трехкратной промывкой 1X PBS. Окрашивание оценивали с помощью 10-кратной широкополосной флуоресцентной визуализации с использованием IXM-LZR и обрабатывали с помощью Metaxpress и ImageJ.

Секвенирование и анализ РНК
РНК собирали из клеток с использованием набора Omega ENZA Total RNA kit и оценивали на качество и целостность с помощью Agilent Tapestation. Подготовка библиотеки и секвенирование парных концов на 150 п.н. были выполнены на Illumina Novaseq компанией Novagene. Файлы для чтения Fastq были обработаны с помощью FastQC. Адаптеры Illumina были удалены с помощью TrimGalore! (Версия 0.4.0, Babraham Bioinformatics) и приведено в соответствие с геномом mm10 с использованием Hisat2 (версия 2.2.1) [76]. Выровненные считывания собирали с использованием StringTie (версия 1.3.3b) [77], и оценивали уровень экспрессии и транскрипты. Дифференциальную экспрессию определяли с использованием DESeq2 [78], с FDR <0,05.

Анализ сигнатурных ассоциаций
Связь логарифмических изменений экспрессии генов, индуцированных химическими коктейлями C1-6 в фибробластах человека, с установленными транскриптомными признаками старения млекопитающих и ИПСК, индуцированных OSK (M), была исследована с помощью корреляционного метода Спирмена, как описано ранее [61]. Использованные признаки старения включали тканеспецифичные признаки печени, почек и головного мозга, а также мультитканевые признаки мыши, крысы и человека [61]. Сигнатуры перепрограммирования OSKM включали гены, дифференциально экспрессирующиеся во время клеточного перепрограммирования фибробластов мыши (mouse), и общие транскриптомные изменения во время OSK (M)-индуцированного перепрограммирования фибробластов мыши и человека (mouse and human) [47]. Попарные корреляции Спирмена для изменений экспрессии генов, вызванных химическими коктейлями, и транскриптомных сигнатур старения и перепрограммирования OSK (M), были рассчитаны на основе объединения 300 лучших генов с наименьшим p-значением для каждой пары сигнатур.

Для идентификации обогащенных функций, затронутых химическими коктейлями, мы выполнили функциональное GSEA [79] в предварительно ранжированном списке генов или белков на основе log10 (p-значения) с поправкой на знак регуляции, рассчитанный как:

где pv и lfc - это p-значение и logFC определенного гена, соответственно, полученные из выходных данных edgeR, а sgn - это функция signum (равная 1, -1 и 0, если значение положительное, отрицательное или равно 0 соответственно). В качестве наборов генов для GSEA использовались онтологии HALLMARK, KEGG и REACTOME из базы данных молекулярных сигнатур (MSigDB). Алгоритм GSEA выполняли отдельно для каждого коктейля с помощью пакета fgsea в R с 5000 перестановками. P-значения корректировали методом Бенджамини-Хохберга. Скорректированное значение среза p, равное 0,1, использовалось для выбора статистически значимых функций. Аналогичный анализ был выполнен для сигнатур экспрессии генов старения и перепрограммирования OSK (M).

Анализ транскриптомных часов
Для оценки транскриптомного возраста (tAge) фибробластов, обработанных химическими коктейлями, мы применили транскриптомные часы с хронологией нескольких тканей человека, скорректированные на продолжительность жизни биологических грызунов (мышь + крыса) и гибридов (мышь + крыса + человек) на основе идентифицированных признаков экспрессии генов старения [52]. Для предварительной обработки данных отфильтрованные данные о количестве RNAseq были переданы в log transformation and scaling. Отсутствующие значения, соответствующие генам clock, не обнаруженным в данных, были сопоставлены с предварительно рассчитанными средними значениями. Оцененные значения выборки были сосредоточены вокруг среднего значения контрольных клеток в состоянии покоя. Попарные различия между средними показателями стареющих необработанных клеток и либо стареющих клеток, либо стареющих клеток, обработанных коктейлями C1-6, оценивали с помощью независимых t-тестов. Полученные p-значения были скорректированы с помощью метода Бемджамини-Хохберга.

Конфликты интересов
Декларация интересов: D.A.S. является консультантом, изобретателем, членом правления и в некоторых случаях основателем и инвестором в Life Biosciences (компанию по перепрограммированию), EdenRoc Sciences / Cantata / Dovetail / Metrobiotech, InsideTracker, Fully Aligned, Zymo, Athletic Greens, Levels Health, Galilei, Immetas, Animal Biosciences, Tally Health и другие. См. https://sinclair.hms.harvard.edu/david- ... filiations. J-H.Y., T.D., C.A.P. и D.A.S. являются изобретателями по предварительной патентной заявке.

Этическое заявление
Мы прочитали рекомендации по наилучшей практике COPE и следовали им. В этом исследовании не проводились работы с животными.

Финансирование
Это исследование было поддержано грантами Фонда Хоффа, Фонда медицинских исследований Гленна, Фонда Хоффа и NIH / NIA (R01AG019719). V.N.G. поддерживается грантами NIA. X.T. был поддержан NIH / NIA (K99AG068303). J-H.Y. был поддержан Национальным исследовательским фондом Кореи 2012R1A6A3A03040476.

[admin_]

Исследователи медицинской школы Университета Вирджинии обнаружили ключевой фактор хронического воспаления, который ускоряет старение. Результаты исследования были опубликованы в журнале Nature Aging.
Ученые обнаружили, что макрофаги (клетки в организме животных, способные к активному захвату и перевариванию бактерий, остатков погибших клеток и других чужеродных или токсичных для организма частиц) с возрастом теряют способность усваивать и использовать кальций. Этот элемент играет ключевую роль в энергообмене клеток.
Исследователи считают, что именно неспособность макрофагов использовать кальций приводит к хроническому воспалению в организме. Оно в отличие от острого воспалительного процесса, протекает незаметно и грозит серьезными последствиями для организма. Оно нарушает ход внутренних процессов, приводит к поражению тканей и органов, а также ускоряет старение.
По словам специалистов, совершенное ими открытие позволит в будущем разработать методы замедления процессов старения систем организма, включая сердечно-сосудистую и нервную.